硝酸鹽是污水處理廠尾水中氮的主要形式, 15 mg·L-1的總氮含量能夠滿足城鎮污水處理廠污染物排放的一級A標準, 但仍遠超2 mg·L-1的地表水環境V類水標準.硝酸鹽的積累導致水體富營養化, 對環境造成極大的危害.另外, 飲用水中硝酸鹽含量過高還可能會引發癌癥, 危害人體健康.因此, 對低濃度硝酸鹽水體的深度處理也日益受到重視.
生物脫氮是一種**、經濟、環保的脫氮方法, 在水體修復過程中經常利用反硝化細菌進行硝酸鹽的脫除.但是反硝化細菌活性受環境影響較大, 如碳源、硝酸鹽濃度、pH和溫度等.有研究表明, 低溫能夠抑制酶的活性, 減緩微生物的生長, 導致反硝化作用明顯減弱.反硝化細菌生長的*佳溫度為25~35℃, 而我國冬季氣溫通常低于20℃, 低溫成為冬季微生物反硝化脫氮的限制性因素.目前關于反硝化細菌的研究主要集中于對硝酸鹽去除能力的提高, 對低溫限制下低濃度硝酸鹽水體中反硝化作用的研究仍然較少. Huang等報道Acinetobacter sp. Y16在實驗室低溫條件下能夠取得良好的去除效果, 但沒有進一步考察其在水體修復長期應用過程中的穩定性.
本研究分離得到1株低溫反硝化菌——施氏假單胞菌, 命名為N3.在此基礎上, 考察了初始硝酸鹽濃度、溫度, 特別是低溫對N3反硝化性能的影響.由于水體中C/N普遍較低, 碳源缺少對微生物脫氮產生抑制, 因此本研究分析了不同C/N對硝酸鹽去除性能的影響.
1 材料與方法1.1 培養基
溴百里酚藍培養基(BTB, g·L-1):L-天冬氨酸10; KNO3 10; KH2PO4 10; FeCl2·6H2O 0.5; CaCl2 1.5; MgSO4·7H2O 10. BTB(1%乙醇溶液)10 mL; pH 7.0~7.3.
反硝化培養基(g·L-1):檸檬酸鈉5; KH2PO4 1; K2HPO4 1; KNO32; MgSO4·7H2O 0.2. pH 7.2~7.5.
亞硝酸鹽培養基(g·L-1):檸檬酸鈉5; KH2PO4 1; K2HPO4 1; NaNO22(過濾除菌); MgSO4·7H2O 0.2. pH 7.2~7.5.
1.2 菌株的分離和鑒定
將10 mL泥水混合物轉移到100 mL反硝化培養基中, 15℃下連續富集培養.將富集培養后的菌液系列稀釋, 分別取10-4、10-5、10-6、10-7濃度下菌液200 μL, 均勻涂布到BTB平板上, 反復分離純化后挑取藍色單菌落, 進行后續研究.
基于菌株的16S rDNA序列進行菌種鑒定.菌體總DNA參照EasyPure Genomic DNA Kit(北京全式金生物工程有限公司)的方法進行提取.采用細菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行擴增, PCR反應體系(50 μL): 10×Buffer 5.0 μL, dNTPs 4.0 μL, 上游引物和下游引物各1.0 μL, 重蒸水38 μL, 離心混勻后加入DNA模板0.5 μL, Taq酶0.5 μL. PCR反應條件:① 94℃預變性5 min; ② 94℃變性50 s; ③ 52℃退火60 s; ④ 72℃延伸90 s; ⑤ 72℃, 10 min; ②~④步驟循環30次. PCR產物純化后交由上海生工生物有限公司進行測序.
將獲得的細菌16S rDNA序列(MF521886)提交到NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), 利用Blast進行比對, 并結合已有研究中得到驗證的相關反硝化細菌序列, 進行同源性比較.利用MEGA7.0軟件進行多序列比對分析, 并用Neighbor-Joining法構建系統發育樹.
1.3 理化指標分析方法
亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮的濃度分別按照N-(1-萘基)-乙二胺光度法、紫外分光光度法、過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法測定, 儀器采用UV 5200紫外/可見分光光度計.去除率按照以下公式計算:

　　式中, ci代表初始氮濃度(mg·L-1), ct代表終態氮濃度(mg·L-1).

　　1.4 NarG、nirS和nosZ基因的擴增

　　反硝化功能基因narG、nirS和nosZ的擴增引物和條件見表 1, 得到的PCR產物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.

 

　　表 1 PCR擴增過程中的引物和程序設計

　　1.5 環境條件對反硝化功能的影響

　　分別調節C/N為4、8和12, 溫度為4、10、20、30、40、50和60℃, 初始硝酸鹽濃度為15、30、40、50、60、70、80、90和100 mg·L-1, 研究不同C/N、溫度、硝酸鹽濃度對反硝化過程的影響.每個實驗均設3個平行, 同時設空白實驗作對照.除上述單因素影響實驗外, 硝酸鹽初始濃度為15 mg·L-1, 反應溫度為30℃, C/N=8.

　　1.6 低溫對反硝化功能及基因表達的影響

　　分別于4、10和15℃下, 定時檢測硝酸鹽的去除情況.在4、10和30℃條件下, 分別在反應36 h時取一定量的菌液, 6 000 r·min-1離心5 min, 棄上清, 用適量無菌生理鹽水重懸, 調節D600為1.各自吸取2 mL菌液, 用Trizol法(北京全式金生物有限公司)提取基因組RNA, 用PrimeScriptTMRT reagent Kit(大連寶生物工程有限公司)進行反轉錄, 隨后利用SYBR Premix Ex TaqⅡ(大連寶生物工程有限公司)進行定量PCR, 對narG、nirS基因的表達活性進行檢測.實驗中用到的引物和反應條件詳見表 1.

　　1.7 低溫下固定化反硝化菌的運行穩定性實驗

　　用10 mL菌體含量為0.2 g的濕菌體與10%的PVA和1%的SA溶液混合均勻, 緩慢滴入1% CaCl2飽和硼酸溶液中, 4℃交聯24 h進行固定化, 制備得到直徑為0.5 cm左右的均勻小球.將固定化后的N3投加到垂直流裝置中, 采用人工配制的低污染水(水質指標見表 2), 以2~3 d為一個進水周期, 在10℃下進行半連續實驗.初始C/N=8, 穩定運行4個周期后, C/N調為4.每12 h定時取樣, 檢測硝酸鹽的去除.

　　表 2 人工配制的低污染水基本水質指標

2 結果與討論2.1 菌株的分離和鑒定
在15℃時, 采用反硝化培養基經連續富集培養、BTB平板篩選, 得到1株反硝化細菌.它能夠在36 h內將硝酸鹽完全去除, 且沒有亞硝酸鹽的積累, 命名為N3.
菌株N3在富集培養基平板上培養24 h, 菌落呈圓形, 淡黃色, 半透明狀, 邊緣光滑.細胞為短桿狀, 大小為(1.5~2.0 μm)×(0.8~1.5 μm), 革蘭氏染色呈陰性.系統發育樹如圖 1所示, 菌株N3與施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)在同一分支, 同源性達99%, 可初步鑒定為施氏假單胞菌.

　　圖 1

圖 1 基于N3的16S rDNA序列和其他相關序列構建的系統發育樹

　　為進一步驗證N3的反硝化能力, 對N3進行了反硝化功能基因的檢測.由圖 2可見, 反硝化功能基因narG、nirS和nosZ均成功地從N3基因組中得到擴增.

　　圖 2

圖 2 反硝化過程中功能基因narG、nirS及nosZ的擴增NarG基因編碼膜結合硝酸鹽還原酶, 能夠在缺氧條件下催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽, 是反硝化過程的**步.生成的亞硝酸鹽進一步被還原為NO, 這是反硝化過程中的限速步驟, 因此編碼亞硝酸鹽還原酶的基因nirS和nirK被認為是區分反硝化和其它氮還原過程的關鍵基因. Heylen等的研究表明, 相比nirK, 由nirS編碼的亞硝酸鹽還原酶更容易接受電子, 進行反硝化. N3中nirS的存在部分解釋了菌株N3所具有的**反硝化能力.尤其重要的是N3中含有nosZ基因, 其編碼的氧化亞氮還原酶能夠催化N2O轉化為N2, 這表明利用N3進行反硝化脫氮能夠減少溫室氣體N2O的釋放.
2.2 不同環境因子對反硝化作用的影響2.2.1 不同C/N對反硝化作用的影響水體中的硝酸鹽不僅能夠通過反硝化作用從水體中脫除, 還可以通過微生物同化作用轉化為自身生物量, 或者經異化還原作用重新以銨根離子的形式釋放到水體中.因此僅憑硝酸鹽濃度的減少不能判斷為反硝化脫氮, 還需與水體中總氮的去除效果進行比較.如圖 3, 在C/N為8和12時, N3在8 h即可實現總氮的完全去除; 當C/N=4時, 14 h亦可實現90%的總氮去除率.這與水體中硝酸鹽的去除效果基本一致, 表明N3主要通過反硝化作用完成整個脫氮過程.

　　圖 3

圖 3 不同C/N下硝酸鹽與總氮的去除及亞硝酸鹽的積累在微生物反硝化過程中, 碳源不僅為菌體生長提供能量, 也是硝酸鹽還原的主要電子來源.目前我國污水處理廠尾水中C/N普遍較低, 在對尾水進行進一步處理時, 碳源供應不足嚴重抑制了反硝化細菌的生長, 導致硝酸鹽去除率不高. Taylor的研究發現Providencia rettgeri YL在C/N=10時去除性能*佳, Chen等也得出了相似的結論.而本研究得到的菌株N3在C/N=8時去除效果*佳, 在8 h內即可完全去除硝酸鹽, 平均去除速率為1.87 mg·(L·h)-1.當C/N進一步增加到12時, 去除率并沒有太大變化, 甚至出現輕微下降, 這與Joo等的研究結果相一致, 可能是因為此時菌體生長所需的能量充足, 碳源成為非限制性因素(圖 3).即使在C/N=4時, N3在14 h內仍可達到90%的去除率, 能夠滿足低C/N水體中硝酸鹽去除的需要.在2~8 h存在亞硝酸鹽積累的峰值, 但其積累量低于0.1 mg·L-1, 并迅速降低.這可能是因為反硝化過程中氧化還原電位高的硝酸鹽對電子的競爭能力大于亞硝酸鹽, 從而導致少量亞硝酸鹽的積累, 與李衛芬等的研究結果相一致.
當以亞硝酸鹽為**氮源時, 總氮與亞硝酸鹽的去除基本一致, 表明N3可以利用亞硝酸鹽為底物進行反硝化.如圖 4所示, N3在C/N為8和12時均能在6 h內將硝酸鹽完全去除.在C/N=4時, N3反硝化速率相對較慢, 但8 h后脫氮率仍能達到95.54%.總之, N3可利用硝酸鹽和亞硝酸鹽為底物進行代謝, 這與牟東陽等[22]的實驗結果一致.上述結果表明, N3能在短時間內實現良好的反硝化效果, 對低C/N水體中硝酸鹽的去除具有重要意義.

　　圖 4

圖 4 不同C/N下亞硝酸鹽和總氮的去除率
2.2.2 不同硝酸鹽濃度對反硝化作用的影響作為反硝化作用的底物, 硝酸鹽對反硝化過程產生重要影響. Mulholland等的研究表明, 隨著硝酸鹽濃度增加, 反硝化脫氮量也隨之增加, 但是氮去除速率卻呈現下降趨勢.在水體修復過程中, 經常出現水體受外界沖擊, 硝酸鹽負荷過高的情況, 因此有必要研究硝酸鹽濃度對N3反硝化過程的影響.
如圖 5所示, 在硝酸鹽濃度低于70 mg·L-1時, N3能夠在48 h內將硝酸鹽完全去除.隨著硝酸鹽濃度繼續增加, 去除率略有下降.可能是由于高滲透壓對微生物的活性產生抑制作用.另外, 消耗的碳源也隨著硝酸鹽濃度的增加而增加, *終因電子供應不足導致硝酸鹽不能被完全還原, 去除效果下降.在硝酸鹽濃度為100 mg·L-1時, N3仍然能夠實現80%的脫氮率, 脫氮效果良好.總體看來, 硝酸鹽濃度低于100 mg·L-1時, N3受硝酸鹽濃度影響不大, 能夠滿足水體中硝酸鹽去除的需要.

　　圖 5

圖 5 不同硝酸鹽濃度下菌株N3在48 h后的硝酸鹽去除效果
2.2.3 不同溫度對反硝化作用的影響
長期以來, 溫度一直被認為是影響反硝化作用的重要因素.在適宜的溫度范圍內, 溫度越高, 微生物生長越快, 酶活性也越高.一般來說, 溫度低于20℃時, 對微生物表現出明顯的抑制作用.在10℃時Pseudomonas stutzeri YZN-001和Bacillus sp. strain YX-6幾乎不生長, 而N3在4℃時仍然具有40%以上的去除率(圖 6).且在50℃高溫時, 仍然能夠去除80%以上的硝酸鹽.當溫度繼續升高到60℃時, 去除率只有30%, 可能是因為高溫破壞酶的結構, 抑制細胞正常的代謝活動, 導致去除率下降.在4~30℃范圍內, N3的硝酸鹽去除速率由0.27 mg·(L·h)-1上升到0.63 mg·(L·h)-1.當溫度繼續升高, 速率保持不變, 直至60℃時, 反應速率下降到0.23 mg·(L·h)-1, 這與其去除率的變化保持一致.李衛芬等篩選得到的反硝化細菌F1在溫度低于25℃或高于35℃時菌株的生長即受到抑制.相比之下, N3在4~50℃范圍內均能實現40%以上的去除率, 具有更寬廣的溫度適應范圍.尤其重要的是, N3對低溫的適應性為冬季水體中硝酸鹽的去除提供了一個潛在解決方案.

　　圖 6

圖 6 不同溫度條件下的硝酸鹽去除效果
2.3 N3對低溫的適應性2.3.1 低溫下N3的硝酸鹽去除效果及反硝化功能基因的表達檢測
低溫對酶的活性有強烈的抑制作用, 進而影響微生物的生長和代謝, 導致反硝化細菌冬季脫氮效果不理想[2].如圖 7所示, 在剛開始的20 h, N3對低溫有一個適應期, 硝酸鹽去除表現出延滯作用.隨后去除率迅速增加, *終在36 h內實現對硝酸鹽的完全去除.冬季人工濕地水力停留時間一般在2~10 d, 良好的低溫適應性使得N3成為冬季人工濕地中反硝化脫氮的候選菌株, 具有良好的應用前景.

　　圖 7

圖 7 N3在4、10及15℃下對硝酸鹽的去除
采用定量PCR技術對反硝化基因narG、nirS在4、10與30℃條件下的表達進行檢測, 結果如圖 8所示.在各溫度下, narG的基因豐度在2.03×108~2.99×108 copies·mL-1之間, nirS的基因含量在2.27×108~2.83×108 copies·mL-1之間, 各溫度之間相差不大.而對于基因表達來說, 4℃和10℃下, narG的表達量在1.74×107~1.95×107 transcripts·mL-1菌液之間, nirS的表達量在1.56×107~1.74×107 transcripts·mL-1菌液之間, 為30℃下表達量的1/3~1/2.低溫通過抑制反硝化基因的表達影響菌的生長和酶的活性, 進而導致反硝化速率的下降, 但是反硝化能力的高低還可能與mRNA的壽命及蛋白質的活性等有關, 需要進一步地研究進行驗證.

　　圖 8

圖 8 4、10及30℃條件下narG及nirS的基因豐度及表達情況
2.3.2 低溫下固定化反硝化菌的運行穩定性實驗在實驗室條件下, N3具有良好的低溫反硝化效果.但是游離菌對不良環境抵抗力差, 容易流失, 在水體修復過程中具有一定的局限性.固定化技術能有效提高微生物對不良條件的抗性, 防止菌種流失.本研究采用PVA和SA對N3進行固定化, 進行低溫半連續實驗.
如圖 9所示, 在運行的前4個周期內, 單個周期內反硝化細菌12 h的脫氮率即達到50%, 24 h去除率大于90%.調整C/N=4后, 初期受低濃度碳源的限制, 硝酸鹽去除效果較之前有所下降, 但仍能實現90%的去除率.運行15 d后, 硝酸鹽的去除達到穩定, 去除率始終保持在95%以上, 具有良好的穩定性.另外, 經固定化N3處理后的水體始終清澈, 沒有因反硝化產氣而破裂, 也觀察不到菌體外泄現象, N3始終保持較好的活性.在連續運行的54 d內固定化N3保持良好的機械強度及去除穩定性, 能夠滿足水體處理的需要.

　　圖 9

圖 9 固定化反硝化菌的半連續實驗

　　3 結論

　　(1) 從富營養化水體中分離得到1株低溫反硝化細菌N3, 革蘭氏陰性菌.菌株鑒定結果表明, N3為施氏假單胞菌.

　　(2) 菌株N3在C/N=8, 硝酸鹽濃度低于70 mg·L-1時, 能實現硝酸鹽的完全去除. N3具有良好的低溫適應性, 4℃時可在36 h內實現對15 mg·L-1硝酸鹽的完全去除; 反硝化基因narG、nirS的表達與30℃處于同一個數量級.在10℃下的低溫半連續實驗中, 固定化N3在運行的54 d中無菌體外泄情況且去除效果穩定, 可作為低溫低C/N下的反硝化候選菌株, 對于冬季水體中硝酸鹽的去除具有良好的應用潛力.